期刊简介
本刊坚持以马克思主义、毛泽东思想为指导，遵循党的基本路线，贯彻理论与实践相结合，普及与提高相结合，“百花齐放，百家争鸣”的方针，坚持面向科研、教学、临床和防治，充分反映我国病原生物学的研究水平，促进我国病原生物学事业的发展。
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首页>中国病原生物学杂志
- 杂志名称：中国病原生物学杂志
- 主管单位：中国寄生虫病防治杂志
- 主办单位：中华人民共和国卫生部
- 国际刊号：11-5457/R
- 国内刊号：11-5457/R
- 出版周期：月刊
期刊荣誉：中华预防医学会、系列杂志优秀期刊期刊收录：上海图书馆馆藏, 北大核心期刊(中国人文社会科学核心期刊), 统计源核心期刊(中国科技论文核心期刊), 维普收录(中), 国家图书馆馆藏, 知网收录(中), 万方收录(中), CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版)
基于TaqMan探针的荧光定量PCR技术在PCV2检测中应用研究
刘波；郭红艳
关键词：PCV2, TaqMan, 荧光定量PCR, 病毒检测
摘要：目的 针对猪圆环病毒(PCV2)特点,利用TaqMan探针建立一种能够快速、准确并具有临床应用价值的PCV2检测方法.方法 参照GenBank已收录PCV20RF2,利用软件设计合成1对特异引物以及与之相匹配的特异性TapMan探针,采用PCR对PCV2衣壳蛋白部分基因进行克隆并鉴定,将纯化回收产物连接至pMT19-T载体,然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞,涂布至Amp+琼脂平板,筛选阳性克隆并扩大培养,进行2％琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序.采用矩阵法确定引物和探针佳浓度.对基于TapMan探针的实时荧光定量PCR循环进行优化,筛选佳退火温度.以100～109倍稀释的标准品为模板,进行敏感性试验.提取CSFV、PRRSV、PRV和PCV1的DNA(CSFV和CSFV在提取RNA后反转录成cDNA)作为模板,进行TapMan荧光定量PCR,检测其特异性.采用105～108倍稀释的标准品为模板进行重复性实验,其中批内和批间均重复4次,根据所得值计算变异系数.结果 PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后大小为114 bp,与预期相符;测序分析PCR产物序列与参考序列同源性为100％.优化的PCR条件为:引物和探针浓度为10 μmol/L,退火温度60℃.建立了PCV2 TaqMan实时荧光定量PCR检测标准曲线,起始模板拷贝数为38.403,斜率为-3.69,相关系数R2为0.998,曲线呈线性.检测方法的敏感性为10 2拷贝/μl质粒标准品,是常规PCR检测敏感性的100倍.特异性检测显示,CSFV、PRRSV、PRV和PCV1扩增反应均阴性.重复性检测显示,PCR扩增循环阈值平均值基本一致,其变异系数均小于2％.采用TaqMan荧光定量PCR方法检测40份样品14份阳性,阳性率35.0％;普通PCR检测11份阳性,阳性率27.5％,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 建立的PCV2TaqMan实时荧光定量PCR检测方法具有以下优点:1)敏感性高,能够用于精确计算PCV2病毒载量;2)特异性强,适用于检测PCV2与其他病原混合感染;3)用时短且可靠性强,可用于PCV2感染检测.
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